m6A与肿瘤微环境及单细胞相关直播回放及问题解答（含直播PPT） | m6A专题

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1. m6A测序跟RIP-seq在课题设计上要结合起来？

答：这个问题其实在之前的直播中有反复提到，详情请点击（关于m6A-IP-qPCR和RIP-qPCR公开课问题集锦、m6A高分文章中高频实验及目的：千人同时在线，联川m6A公开课超长版问答合集1）。这边再简单说下，m6A测序本身检测的是带m6A修饰的RNA，RIP-seq其实是RNA结合蛋白所结合到的靶基因的检测工具。

如上图所示，跟m6A相关的一些酶比如reader蛋白IGF2BP1等是否有结合上带有m6A修饰的RNA，需要RIP-seq来做进一步验证。所以最后对应的基因既有m6A修饰也被蛋白给binding上。这就是为啥后期高分文章既要做m6A测序也要做RIP-seq。假如有某个蛋白A的RIP-seq的信号，但是没有m6A测序的信号，说明这个靶基因尽管被蛋白A结合，但是不带m6A修饰。

2. 单细胞测序这个技术还能坚持多少年高分文章？换句话说，现在单细胞测序还好不好发高分文章了？

答：这个问题如果补充完整的话，其实是否可以理解为占坑类或者蹭热点的单细胞还能发高分文章？其实pubmed上每个月生物医学类甚至是农业方向，单细胞测序在高分文章中占比仍然比较高。但是反过来讲如果是占坑性质的单细胞测序文章，基本上一些领域内的大佬快发完了。如果你觉得你的样本或课题设计其他课题组也能想到，大概率会被抢发，毕竟这类研究没啥特别强的创意，属于先到先得。但是只要你的生物学故事比较新颖，大概率还是能发高分文章的。所以最终能不能发高分，跟你的课题设计大概率相关。你要经常思考为啥其他课题组能发了这个杂志，研究清楚背后的逻辑更关键。

3. 做单细胞后续要做机制验证还不是要做哪些实验？

答：这边其实是有答案的，详情点击联川生物前面发过的材料（做完单细胞测序还需要开展哪些验证实验？| 单细胞专题）。基本上后期验证以免疫组化、RNA FISH探针等方式为主。部分研究如果有合适的抗体，可采用流式分选及磁珠分选的方式，对分选后的细胞进行smart-seq、微量蛋白组学、共培养phenotype观察等实验。这边大家还是可以通过大量阅读近期发表的单细胞文献，了解一些具体的情况

4. 如果研究细胞互作，把两种细胞养在一起这种方法可行吗？

答：细胞共培养（Co-Cultivation）是一种较为常见的研究细胞的方法之一。这种方法将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中，由于其具有更好地反映体内环境的优点，所以这种方法被广泛应用于现代细胞研究中。具体资料可打开 https://link.springer.com/ 搜索关键词“cells”和“Co-Cultivation”，查询各类protocols。

5. 单细胞测序每组一定要至少三个样本吗？

答：这里要厘清几个概念，这边三个样本指的是上机的生物学重复数量，理论上应该叫三个生物学重复。如果是小鼠、斑马鱼等物种，三个生物学重复是最起码的。这边一个生物学重复用几只小鼠或几条斑马鱼跟研究的组织也有关系，最夸张的一次，研究对象是某个器官病灶，混了400只小鼠解剖组织。当然最低2个生物学重复，每个生物学捕获6000个细胞，那么每组至少捕获细胞数量每组要>12000个细胞。

至于临床样本，重复数量肯定是越多越好，但是入组的样本统计学必须要严格控制，例如性别年龄体重药物干预前后等。此外，除非遇到一些很特殊的临床样本一年只能遇到1-2例，一般每组重复不低于5-6例临床样本。

6. 小分子药物怎么与m6A的挂钩？

答：一般自己研究的某种疾病，会有一些酶表达异常情况。最好的情况是酶低表达更好，而酶高表达对疾病属于不利因素。至于小分子抑制剂，例如FTO等目前有现成的小分子抑制剂，在NIH小分子化合物库中也能找到对应的小分子。其他的m6A甲基化酶，后续可能也可以设计对应的小分子抑制剂。但是前提得拿到对应蛋白的晶体结构。实在不行还有一些间接的抑制剂。类似药明康德等CRO公司，目前也有相关的外包服务，大家感兴趣可以咨询一下。目前最为成熟的以FTO研究较多。建议可以阅读中科院上海药物研究所杨财广教授的相关研究，其合作对象包括陈建军教授、韩大力/徐萌教授、何川教授等。

7. 免疫细胞再细分的依据是什么？过渡细胞怎么办？

答：免疫细胞再分群，目前国际学术界并未有特别公认的金标准。以张泽民教授的文章为例，大部分免疫细胞亚群分类直接按照数字来区分，比如CD8_01、CD4_05等，一般诸如Trm、Treg、Tfh等大类没问题，再要细分后面在根据文章需求和功能具体进行讨论。部分文章亚群分的很细，甚至是根据阳性较高的基因来对亚群进行命名，如HLA+ TAM。甚至部分研究会采用双阳乃至三阳的方式来标记，如CD103+ CD279+ STAT3+ CTL等。至于第二个问题，一些过渡态的细胞则可以通过拟时序分析（pseudotime analysis）来鉴定。这边可以参考下一些影响因子在20分以上的单细胞论文，看下他们是如何解决免疫细胞亚群鉴定是怎么做的。

8. 后期发论文到底是做机制验证还是用单细胞测序比较好？

答：单细胞测序是属于辅助性质的，机制验证，尤其是免疫微环境相关的，该少的一个都不能少。后期验证相关内容前面有所涉及，这边简单再重复下，包括流失或磁珠验证、基因敲除、共培养等。当然RNA FISH和免疫组化当然是绝对不能少的。

9. m6A与肿瘤干细胞有什么好的研究方案吗？

答：首先忘掉m6A，肿瘤干细胞一些热点有哪些？或者说肿瘤干细胞有哪些领域内有待解决的问题没？小编不才，不是该领域专家，根据我对肿瘤干细胞浅薄的理解，几个方向值得考虑，包括HIF-1α、乏氧环境、肿瘤干细胞与耐药、肿瘤干细胞的可塑性（plasticity）等均有大牛发表的研究及综述。结合这些已有的研究成果，里面肯定会有很多关键的基因及表型实验，后期与m6A结合相当于从原有研究的上游机制进行解析。重复下来就是肿瘤干细胞你得知道什么方向是不错的，容易出成果的，后期与m6A相结合（也有点看运气的成分在）。基本上这个适用于所有想要开展m6A研究的老师们。这边推荐一篇名为“Qin S., et al. (2021) The interplay between m6A modification and noncoding RNA in cancer stemness modulation: mechanisms, signaling pathways, and clinical implications. Int J Biol Sci 2021; 17(11):2718-2736”的综述，讲述m6A与肿瘤干性相关研究总结。

10. m5c相关的研究好做吗？有哪些坑容易踩？

答：不敢保证m5C后期的研究趋势会如何，只是目前暂时来看m5C的文章数量远少于m6A。除了m5C包括m1A以及DNA层面的6mA，修饰本身丰度过低及机制未能有很好的诠释外，千万不要觉得这是一片处女地有待我们去挖掘里面的黄金。文章不多另一个可能性就是坑多到数不清楚，可能一些大牛课题组已经替咱们提前踩过一边坑了！

11. m6A跟良性疾病代谢疾病有相关的可以研究

答：该问题与问题9肿瘤干细胞相似，你得先把该领域研究方向和热点做一个罗列，再从m6A的角度去切入。至少你的脑海中得非常清晰地知道哪些基因哪些现象是我所关注的。

12. 在单细胞里发现的亚群，机制验证可以通过把亚群分出来后去做bulk测序吗？

答：如果单细胞测序能鉴定到自己感兴趣的亚型，而且能分离出来肯定是最好的。当然分离出来得保证你分离的抗体是特异性较强的表面蛋白抗体。此外，分离出来除了做bulk测序（smart-seq2当然也属于）外，还可以做微量蛋白组 详情请戳：200个细胞做蛋白质组学？微量蛋白质组学它来了！。除了高通量组学手段，一些验证性的实验，甚至是简单的PCR也可以开展

13. 我研究的是冷肿瘤，免疫浸润的细胞比较少，这种该如何处理呢？

答：抗肿瘤特异免疫反应大致可以分7个步骤：1）肿瘤抗原释放；2）抗原提呈；3）T细胞在引流淋巴结的教育和激活；4）T细胞迁移至肿瘤；5）T细胞穿过血管进入肿瘤；6）T细胞识别肿瘤细胞；7）T细胞杀伤肿瘤细胞。目前其实七个方向里面论文发表较少的是第三个方向也就是，T细胞引流和教育激活。

这边可以参考中山大学孙逸仙纪念医院宋尔卫院士和苏士成教授发表的Nature Immunology最新研究，文章标题为“Targeting Regulator of G-protein Signaling 1 in Tumor-specific T cells Enhances Their Trafficking to Breast Cancer”。该研究发现 G 蛋白信号调节因子 RGS1 可抑制 T 细胞向肿瘤迁移，从而在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用，靶向 RGS1 可能为肿瘤免疫治疗提供一种新策略。

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